Años después un Peter Parker (Andrew Garfield) asiste al Instituto de Ciencias de Midtown, donde es acosado por el matón Flash Thompson (Chris Zylka) y se siente atraído por Gwen Stacy (Emma Stone). Un día Peter encuentra un portafolio de su padre Richard Parker (Campbell Scott) y descubre que estuvo trabajando en Industrias Oscorp con el doctor Curtis Connors (Rhys Ifans), un científico con un brazo amputado. Peter se cuela en Oscorp y se mete en una habitación donde es mordido por una araña manipulada genéticamente adquiriendo las capacidades de trepar por las paredes, superfuerza, sentido arácnido que le advierte del peligro, agilidad y vista mejorada. Después de estudiar los papeles de su padre Peter visita a Connors. Connors en un principio le pide que se vaya, pero lo recibe bien al saber que es el hijo de Richard Parker. Connors explica que en su momento, él y Richard intentaron crear un suero que regenerara o curara cualquier parte del cuerpo humano. El objetivo de ambos era usar el suero para regenerar el brazo incompleto de Connors y ayudar a todas las personas con problemas físicos, pero la investigación se perdió por la misteriosa desaparición de Richard y su esposa Mary (Embeth Davidtz). Peter decide ayudar a Connors a completar la fabricación del suero. En el instituto, Peter usa sus poderes para humillar a Flash Thompson durante un partido de baloncesto, pero acaba destrozando accidentalmente una de las canastas después de humillarlo. El tío Ben se ve obligado a marcharse del trabajo para reunirse con el director, por lo que tiene que trabajar hasta más tarde, así que le pide a Peter que recoja a la tía May a las nueve. Peter y Connors fabrican un suero con ADN de lagarto y se lo inyectan a un ratón con solo tres patas. El ratón recupera su cuarta pata, pero Peter se distrae y se olvida de recoger a la tía May. Por ello, Peter y el tío Ben tienen una discusión que termina con Peter yéndose enfurecido de casa. Peter trata de comprar una caja de leche, pero el encargado de la tienda se niega a dársela por dos centavos. Peter se enfada con el encargado, así que cuando un ladrón asalta la tienda y le da su leche lo dejó escapar. El tío Ben (que había salido a la calle para encontrar a Peter) se cruza con el ladrón y trata de detenerlo, pero este le dispara. El ladrón escapa mientras Peter se acerca a su tío muerto en la acera.
Después de eso, Peter detiene a todos los ladrones que se parecen al asesino de su tío con la esperanza de encontrar al verdadero. En el proceso, Peter cae en un gimnasio donde ve el cartel de un luchador enmascarado. Inspirándose en ese cartel, Peter se hace una máscara roja con cristales de lentes en los ojos a la que añade un supertraje rojo y azul con detalles de telaraña y unos lanzatelarañas que se puede colocar en ambas manos convirtiéndose en el superhéroe Spider-Man. Gwen invita a Peter a cenar a su casa. En la cena, Peter conoce al padre de Gwen, el capitán de policía George Stacy (Denis Leary), que opina que Spider-Man no es más que un delincuente. Después de la cena, Peter le revela a Gwen que él es Spider-Man y los dos se besan.
El superior de Connors, el doctor Rata (Irrfan Khan), presiona a Connors para que pruebe el suero con humanos. Connors se niega ya que sería arriesgarse demasiado, así que Rata lo despide y decide inyectarles el suero a los ancianos del Hospital de Veteranos diciéndoles que es una vacuna contra la gripe. Desesperado, Connors se inyecta el suero en sí mismo y su brazo se cura, así que trata de alcanzar a Rata antes de que llegue al Hospital de Veteranos, pero su piel empieza a volverse verde y escamosa y al llegar al Puente de Williamsburg se convierte en una mezcla violenta entre un hombre y un lagarto. Connors, convertido ahora en el supervillano "El Lagarto" tira varios coches por el puente entre ellos el de Rata, pero Spider-Man llega y usa sus telarañas para salvar varios coches.
Spider-Man sospecha que Connors es el Lagarto y se enfrenta a la criatura en las alcantarillas. El Lagarto lo hiere y Spider-Man muere, pero deja su cámara pegada a la pared. El Lagarto recoge la cámara y lee una etiqueta que dice "Propiedad de Peter Parker" y de esa manera descubre la identidad de Spider-Man. Peter llega a la casa de Gwen y ella lo cura. Al día siguiente el Lagarto pelea con Peter en la escuela que termina con el Lagarto huyendo por la alcantarilla y Spider-Man lo sigue donde descubre que el Lagarto planea soltar desde la Torre Oscorp un gas que convierta a toda la ciudad en hombres-lagarto como él. En respuesta, la policía persigue tanto a Spider-Man como al Lagarto. La policía captura a Spider-Man, pero el capitán Stacy lo deja marcharse después de saber que es Peter Parker. En la batalla final en la Torre Oscorp, el capitán Stacy ayuda a Peter disparándole al Lagarto ya que este arruinó los lanzatelarañas de Spider-Man. El Lagarto le clava sus garras al capitán Stacy mientras Spider-Man logra soltar un gas creado por Gwen que posee el antídoto al suero, por lo que Connors y todos los que habían sido infectados vuelven a la normalidad. El capitán Stacy está herido de muerte, pero le hace prometer a Peter que se alejará de Gwen para protegerla de los enemigos de Spider-Man. Peter se lo promete provocando la tristeza y decepción de Gwen al saberlo ya que no la acompañó al funeral de su padre. Peter llega tarde a clase varios días después pero le promete a la profesora que no volverá a pasar. La profesora le dice a Peter que no haga promesas que no pueda cumplir, pero Peter le responde en voz baja (dirigiéndose a Gwen) que las promesas que no se pueden cumplir son las mejores. Gwen lo oye y sonríe, dando a entender que Gwen y Peter volverán a iniciar su relación.
En una escena post-créditos, Connors es encarcelado, en la celda, un hombre aparece de entre las sombras y le pregunta a Connors si le dijo a Peter la verdad sobre su padre, Connors responde que no y le dice al hombre misterioso que debe dejar en paz a Peter. El hombre desaparece de entre las sombras.
